Yazar "Gül Güven, Reyhan" seçeneğine göre listele
Listeleniyor 1 - 2 / 2
Sayfa Başına Sonuç
Sıralama seçenekleri
Öğe Alicyclobacillus acidocaldarius subspecies rittmannii’nın B-Galaktozidaz enzimi üzerine çalışmalar(2016) Gül Güven, Reyhan; Uyar, FikretBu çalışmada kullanılan Alicyclobacillus cinsine ait MR1 varyetesi Antartika'da ayak basılmamış bir bölgedeki toprak numunelerinden izole edilmiştir. MR1 izolatı Alicyclobacillus 'lara özgü terminal bir siklohekzan bulunduran yağ asitleri içeren lipitler ihtiva etmektedir. Ayrıca, 16S ribozomal DNA analizi ve DNA-DNA homolojisi karşılaştırılmasında bu varyetenin Alicyclobacillus acidoca.ldarius'xax yeni bir alt türü olduğu bulunmuştur (Nicolaus ve ark., 1998). Genetik analizi yapılarak tanımlanan ve patojen olmayan bu bakteri çalışmalarımızda test edilmiştir. Laktozlu ve laktozsuz ortamlarda yaptığımız testlerde, laktozun 24. saate kadar bakteri çoğalması üzerine herhangi önemli bir etkisi olmadığı, ancak 24. saatten sonra bakteri çoğalmasını artırdığı görüldü. Canlı hücrelerde pH'nın p-galaktozidaz aktivitesi üzerine etkisi sodyum sitrat tamponu (PH 4-6) ve sodyum fosfat tamponu (pH 6-9) kullanılarak araştırıldı. Laktozsuz ortamda optimum pH 6, laktozlu ortamda ise optimum pH 7 olarak bulundu. PH 4 ve pH 9 'da her iki ortamda da relatif aktivite (optimum pH'ya kıyasla) 0 (sıfır) olarak tespit edildi. 40-80 °C aralıktaki sıcaklığın enzim üzerine etkisi incelendiğinde; laktozsuz ortamda optimum sıcaklık 60 °C, laktozlu ortamda ise optimum sıcaklık 70 °C olarak bulundu. Laktozlu ortamda 40 ve 50 °C 'lerde relatif aktivitenin laktozsuz ortama göre oldukça yüksek olduğu tespit edildi. Laktozun enzimin stabilitesinde rol aldığı tahmin edilmektedir. 80 °C 'de her iki ortamda da enzim aktivitesi 0 (sıfır) olarak tespit edildi. Sentetik indükleyici IPTG'nin laktoz gibi enzim sentezini indüklediği bulundu. Bakteri hücreleri lizozim enzimi yardımıyla lize edilerek elde edilen enzim solüsyonlarında p-galaktozidaz aktivitesi üzerine pH'nın etkisi 0.1 M sodyum fosfat tamponu (pH 6-9) kullanılarak araştırıldı. Enzimin optimum pH'sı 6 olarak saptandı. 40-80 °C aralıktaki sıcaklığın enzim üzerine etkisi araştırıldı ve enzimin optimum sıcaklığı 60 °C olarak tespit edildi. Enzim ünitesi Lambert-Beer yasasından yararlanarak ünite/ml olarak hesaplandı. 6-48 saatler arasında kültüre alman bakterilerde laktozlu (%1) ve laktozsuz ortamlarda zamana bağlı enzim üretimi çalışıldı. İnkübasyon periyotlarından sonra bakteriler lizozimle lize edilmiş ve elde edilen enzim solüsyonlarında hem enzim aktivite tayini hem de protein miktar tayini yapılarak spesifik aktivite (u/mg) bulunmuştur. Laktozlu ortamda çoğalan hücrelerdeki p-galaktozidaz aktivitesinin 6-24. saatlerde laktozsuz çoğalanlara nazaran oldukça fazla olduğu görüldü. Bununla beraber, 24. saatten Ill sonra enzim aktivitesinde bir düşüş görüldü. Laktozsuz ortamda ise 12. saatten 24. saate kadar hızlı bir artış görülmesine rağmen, sonrasında artış hızının yavaş seyrettiği görüldü. Yukarıda tespit edilen sonuçlar non-denatüre jel elektroforezi ile teyit edildi. Sigma'dan elde edilen prestained moleküler weight marker'lar kullanılarak P-Galaktozidaz'ın görünen moleküler ağırlığı 155 ± 5 kD olarak hesaplandı.Öğe Sıcak su kaynaklarından bakteri izolasyonu, tanımlanması ve Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. Rittmanii'nin ß-galaktozidaz enziminin saflaştırılması(2017) Gül Güven, Reyhan; Ünlü, ErhanTaşlıdere-Batman ve Kös-Bingöl sıcak su kaplıcalarından izole edilen bakterilerin morfolojik, fizyolojik, biyokimyasal özellikleri, lipit ve yağ asidi içerikleri, kinon tipleri ve 16S rRNA dizi analizleri yapılarak identifikasyonları yapılmıştır. Ayrıca Antartika’dan izole edilmiş diğer bir termofilik basil olan Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. rittmannii’nin biyoteknolojik öneme sahip olan ?-galaktozidaz enzimi saflaştırılmış ve saf enzimin bazı özellikleri çalışılmıştır. Kös-Bingöl kaplıcasından izole edilen ve KG5 olarak adlandırılan izolat, çubuk şekilli, Gram-pozitif, fakültatif anaerob, hareketli ve endosporları oval şekilli sentral konumlu olduğu bulunmuştur. KG5 için üreme sıcaklık aralığı 15-45 °C (optimum 40 °C) olarak bulunduğundan mezofilik karakterde bir bakteri olarak tanımlanmıştır. KG5 birçok özellik bakımından Bacillus cereus türüne benzerlik göstermektedir. KG5’in sadece katalaz ve glukoz kullanımının negatif olmasından dolayı Bacillus cereus’un diğer varyetelerinden farklı olduğu tespit edilmiştir. KG5 ile Bacillus cereus türü arasında yağ asidi profili bakımından da benzerlik bulunmuştur. Her iki bakteride de nC16:0 majör yağ asidi, iC15:0 ise ikinci büyük yağ asididir. KG5’te nC18:0 yağ asidinin B.cereus’tan çok daha fazla oranlarda bulunmuştur. Ayrıca, KG5’in 16S rRNA dizisi % 100 oranına yakın B. cereus’a, % 99.9 oranında Bacillus thrungiensis’e ve % 99.8 oranında Bacillus anthracis’e benzediği bulunmuştur. Taşlıdere-Batman kaplıcasından izole edilen ve KG9 olarak adlandırılan izolat çubuk şekilli, Gram-pozitif, fakültatif anaerob ve hareketli, endosporları oval şekilli subterminal konumlu olduğu bulunmuş ve üreme sıcaklık aralığı 30-55 ?C (optimum 50 ?C) olarak bulunduğundan ılımlı termofil karakterde bir bakteri olarak tanımlanmıştır. KG9 birçok özellik bakımından Bacillus licheniformis türüne benzerlik gösterdiği bulunmuştur. % 15 Oranındaki NaCl’ de üreyen KG9’ un halotolerant olduğu tespit edilmiştir.Yağ asidi profiline göre KG9 ve B.licheniformis’te majör yağ asidi iC15:0’tir. Diğer türlerde tespit edilmeyen yağ asidi nC18:0, KG9’da bulunmuştur. KG9’un 16S rRNA dizisinin % 99 oranında Bacillus licheniformis’e benzediği tespit edilmiştir. Taşlıdere-Batman kaplıcasından izole edilen ve KG8 olarak adlandırılan diğer izolatın çubuk şekilli, Gram-pozitif, fakültatif anaerob, hareketli, endosporları oval şekilli subterminal konumlu olduğu bulunmuş ve üreme sıcaklık aralığı 35-65 °C (optimum 55 °C) olarak bulunduğundan ılımlı termofil karakterde bir bakteri olarak tanımlanmıştır.Yağ asidi profilinden KG8 izolatının Anoxybacillus cinsinin üyesi olduğunu ve KG8’in 16S rRNA dizisinin Anoxybacillus kamchatkensis’ e % 99, A.flavithermus, A. ayderensis ve A. gonensis’ e % 98 ve A. pushchiensis’ e ise % 97 oranında benzerliğe sahip olduğu bulunmuştur. KG8 izolatının 16S rRNA dizi analizine göre %99 oranda benzerlik gösterdiği A. kamchatkensis, katalaz negatif, nişasta hidrolizi negatif, optimum üreme sıcaklığı 60 °C iken, KG8, katalaz (+), nişasta hidrolizi (+), ve optimum üreme sıcaklığı 55 °C olarak tespit edilmiştir. ?ki bakteri arasındaki yüksek oranda 16S rRNA dizi benzerliğine rağmen bu gibi farklılıkların görülmesi KG8’in ayrı bir tür olabileceğini göstermektedir. A. kamchatkensis türü ile DNA-DNA hibridizasyonu sonucunda elde edilecek homoloji ile bu izolatın yeni bir tür veya alt tür olup olmadığı ortaya çıkacaktır. Çalışılan bakterilerin lipit analizi yapıldığında ise 3 bakterinin gliko ve fosfolipit ve aminolipitler bakımından basillere benzediği, KG5’ in farklı olarak fosfo-gliko lipit içerdiği tespit edilmiştir. Ayrıca tür teşhisinde kullanılan kinon tipleri çalışılmış, tüm çalışılan izolatların menakinon içerdiği ve KG8 için yapılan ileri çalışmada da bu menakinon tipinin MK-7 olduğu bulunmuştur. Ekstrem şartlara dayanıklı türlerin enzim kaynağı olarak kullanılma potansiyelleri nedeniyle, Antartika’dan izole edilen ve tür teşhisi daha önce yapılan Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. rittmanii’nin endüstriyel açıdan öneme sahip intraselüler bir ?-galaktozidaz enzimi saflaştırılmış ve enzimin bazı özellikleri çalışılmıştır. Saf enzim 113 U/mg spesifik aktivite, 163 kat saflaştırma ve % 8’lik bir verimle elde edildi. Km değeri 8.9 mM olarak hesaplandı. Saf enzim için elde edilen optimum pH ve sıcaklık sırasıyla 6.0 ve 65 ?C’dir. FPLC sistemini kullanarak ?-galaktozidazın nativ (non-denatüre) molekül ağırlığı 165 kD, denatüre şartlar altında ise 76 kD olduğu bulunmuştur. Saflaştırılan ?-galaktozidaz ın molekül ağırlığına, izole edildiği organizmaya ve afinite kromatografisine bağlanamama veya zayıf bağlanma yeteneğine bakıldığında GH-42 ailesinin bir üyesi olabileceği düşünülmektedir. Jel filtrasyon ve SDS-PAGE yöntemi ile enzimin benzer veya aynı alt ünitelerden (76 kD) oluşan oligomerik (dimer veya trimer; non-denatüre moleküler ağırlık 165 kD) bir yapıya sahip olduğu bulunmuştur. Bu çalışmada saflaştırılan A. acidocaldarius subsp. rittmannii ?- galaktozidazının optimum pH ve sıcaklığının uygunluğu, hem kendiliğinden sentezlenen hem de sentezi artırılabilen (indüklenebilen) özelliklerinden dolayı süt ve peynir altı suyu laktozunun hidrolizinde uygun bir kullanım alanına sahip olabileceğini göstermektedir. Bu enzimin endüstride kullanılabilirliği ileri seviyede test edilmesi gerekmektedir. KG9’un nişasta ve kazein hidrolizi pozitif, katalaz pozitif, KG5’in kazein ve jelatin pozitif, KG8’ in ise nişasta hidrolizi pozitif olması bu bakterilerin endüstriyel açıdan önemli olan enzimlerin (amilaz, proteaz vs.) kaynağı olabileceklerini göstermektedir. Termofilik olmalarından dolayı KG8 ve KG9’un önemi daha da artmaktadır. Anahtar Kelimeler: Bacillus, Anoxybacillus, Alicyclobacillus, Bakteri tanımlanması, 16S rRNA, ?-Galaktozidaz saflaştırılması
