Characterization of a thermally stable ?-galactosidase produced by thermophilic anoxybacillus sp. AH1
Citation
Acer, Ö. ve Bekler, F. M. (2021). Characterization of a thermally stable β-galactosidase produced by thermophilic anoxybacillus sp. AH1. Türk Doğa ve Fen Dergisi, 10(1), 130-136.Abstract
Thermostable β-galactosidases from thermophilic bacteria have attracted increasing
interest to have various advantages in industrial and biotechnological applications. In this study, a
highly thermally stable β-galactosidase produced by Anoxybacillus sp. AH1 was purified and
characterized. The highest enzyme production was achieved after the bacterium was incubated
for 24 hours. The enzyme was purified by precipitation with ammonium sulphate dialysis, gel
filtration chromatography using Sephadex G-75. After the purification steps, β-galactosidase was
found to be purified 10.2-fold and a yield of 13.9%. The molecular mass of the β-galactosidase
was estimated to be 75 kDa by SDS-PAGE. The purified enzyme was highly stable and retained
at 71% of the original activity at 60 °C and 53% at 70 oC within 120 minutes. The Km and Vmax
values of purified β-galactosidase were calculated as 1.249 mM and 0.5 μmol minutes-1
,
respectively. Ca2+, Zn2+, and Mg2+ significantly activated β-galactosidase activity, whereas
enzyme activity was inhibited significantly by Cu+2 as well as by the metal ion chelators1,10-
phenanthroline (phen) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA). The Purified β-galactosidase
activity was increased by PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), PCMB (pchloromercuribenzoic acid), DTT (dithiothreitol), and β-ME (β-mercaptoethanol) at 2 mM, but
inhibited completely by NEM (N-ethylmaleimide) at 1 mM. Termofilik bakterilerden elde edilen termostabil β-galaktosidazlar, endüstriyel ve
biyoteknolojik uygulamalarda çeşitli avantajlara sahip oldukları için ilgi çekmektedir. Bu
çalışmada, Anoxybacillus sp. AH1'den üretilen, oldukça termostabil olan β-galaktosidaz,
saflaştırıldı ve karakterize edildi. En yüksek enzim üretimi, bakterinin 24 saat inkübe
edilmesinden sonra elde edildi. Enzim, amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz ve jel filtrasyon
kromatografisi (Sephadex G-75) kullanılırak saflaştırıldı. Saflaştırma aşamalarından sonra, βgalaktosidazın % 13,9 verimle 10,2 kata kadar saflaştırıldığı tespit edildi. β-galaktosidazın
moleküler kütlesi, SDS-PAGE ile 75 kDa olarak tahmin edildi. Saflaştırılmış enzimin oldukça
stabil olduğu ve 120 dakika sonunda 60 °C'de orijinal aktivitenin % 71'ini, 70 °C'de ise % 53'ünü
koruduğu tespit edildi. Saflaştırılmış β-galaktosidazın Km ve Vmax değerleri sırasıyla 1,249 mM
ve 0,5 μmol dakika-1
olarak hesaplandı. Ca2+, Zn2+ ve Mg2+ β-galaktosidaz aktivitesini önemli
ölçüde aktive ederken, Cu2+ ve metal iyon şelatörleri, 1,10-phenanthroline (phen) ve
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) enzim aktivitesini önemli ölçüde inhibe etmiştir.
Saflaştırılmış β-galaktosidaz aktivitesi 2 mM PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), PCMB (pchloromercuribenzoic acid), DTT (dithiothreitol), ve β-ME (β-mercaptoethanol) ile artar iken, 1
mM NEM (N-ethylmaleimide) ile tamamen inhibe edildiği belirlendi.